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Automate Cells-to-CT™ Kits for High Throughput Expression Analysis

The Cells-to-CT™ Kits for TaqMan® and SYBR® Green-based real-time PCR take you from cells in culture to real-time RT-PCR analysis without RNA purification. The Cells-to-CT system uses a proprietary method for lysing cultured cells while simultaneously removing genomic DNA and preserving RNA integrity, saving significant time and effort over traditional methods requiring RNA purification. Here, Applied Biosystems scientists demonstrate the ease with which the Cells-to-CT methodology can be automated for high throughput gene expression analysis.

Simple Procedure Amenable to Automation

The Cells-to-CT™ Kits for TaqMan® and SYBR® Green-based real-time PCR make it possible to perform gene expression analysis using cultured cells without purifying RNA. Cells can be processed directly in 96- or 384-well culture vessels using a 2-step, 7 minute procedure that does not require the heating, centrifugation, or vacuum filtration procedures that are typically required for RNA isolation (Figure 1). The simplicity of the Cells-to-CT method makes it extremely amenable to use with even the most basic automated liquid handling systems. Automation reduces labor and plastic consumption, and minimizes the opportunity for cross-contamination, sample loss, and other human errors. As a result, automating the Cells-to-CT protocol provides researchers with an easier, more reproducible gene expression analysis workflow suitable for high throughput projects. Using commonly available robotic systems, the Cells-to-CT Kits can be automated to prepare 384 unique cell samples for real-time RT-PCR in less than 10 minutes—less than 1.5 seconds per sample!

Sample Mixing is Not Required

The protocols for manually processing cells with Cells-to-CT Kits recommend mixing samples after the addition of both the the Lysis and Stop Solutions. To facilitate automation of the procedure, we investigated whether these sample mixing steps are required for reproducible, high quality real-time PCR data using the TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit. After the addition of Lysis and Stop Solutions, samples were either mixed by pipetting 5 times (the standard recommended protocol), shaken for 30 seconds, or not mixed. Very similar CT values and levels of reproducibility were obtained across these different sample mixing conditions (Figure 2), indicating that, with small samples of HeLa cells, the mixing step can be omitted from the Cells-to-CT sample preparation procedure. (Note: this data was generated using 4,000 HeLa cells, which are are relatively easy to lyse. Results may be different with other cell lines and different cell numbers. The no-mix protocol should be evaluated with the cell lines and quantities in the experimental system before conducting larger experiments). Eliminating these mixing steps not only makes the procedure even simpler and more rapid, but it has the added benefit of dramatically reducing the number of pipette tips needed for the procedure. The result is a faster, more economical procedure with fewer steps.

Figure 2. Comparable Results with Different Mixing Treatments Using the TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ Kit. 16 replicate samples, each consisting of 4,000 HeLa cells, were processed following the instructions provided with the kit. After adding the Lysis and Stop Solutions, samples were either shaken for 30 sec, mixed by pipetting 5 times, or not mixed at all. The lysates were then used in real-time RT-PCR with TaqMan Gene Expression Assays for 18S rRNA or b-actin. Comparable average CT values were obtained regardless of the mixing treatment, indicating that mixing could be eliminated from the protocol to reduce tip usage and 마이크로 및 스탠다드 FX 계좌 cost. (Note that the error bars represent the standard deviation of the mean of 16 biological replicates.

Reproducible Results

Automated on a Biomek® FX Workstation, the Cells-to-CT no-mix procedure results in gene expression data with equivalent sensitivity and reproducibility to the standard manual Cells-to-CT methodology, while reducing labor and minimizing cross-contamination. Figure 3 demonstrates the wide dynamic range, high sensitivity, and excellent reproducibility achieved with the automated procedure. Figure 4 demonstrates that cross contamination is minimized with the automated protocol. The resulting lysates are compatible with the full range of optimized Applied Biosystems TaqMan and SYBR Green PCR master mixes.

Figure 3. Automating the Cells-to-CT™ Procedure Results in Sensitive, Reproducible Expression Data. The average CT value of 16 biological samples per MCF-7 cell concentration on a 96-well flat-bottomed tissue culture plate was determined for ß-actin (orange squares), 18S (blue circles), and LDHA (green triangles) using the TaqMan® Cells-to-CT Kit and TaqMan Gene Expression Assays.

Figure 4. Cross Contamination is Minimized with the Automated Cells-to-CT™ 마이크로 및 스탠다드 FX 계좌 Procedure. Real-time PCR for HPRT1 was carried out on 224 biological replicates (2,500 HeLa cells per well) interspersed with cell-free blanks (160 wells, arranged to spell out “C2CT”) in a 384-well flat-bottomed culture plate. The CT values for blank wells were >35 in all cases (orange wells) while the average CT value for the samples was 30.7 ± 0.5 showing that there was no cross-contamination between wells. ΔCT (HPRT1–ß-actin) of wells containing cells was 5.4 ± 0.4—this low error indicates that differences in CT values across the plate are due to differences in cell number rather than to real-time PCR variation.

Conclusions

Automating the Cells-to-CT procedure results in a more efficient usage of time, labor, and plastics, yet maintains the highest quality gene expression data with equivalence to the standard methodology.

Scientific Contributors:
Ronald V. Abruzzese, Richard Fekete • Applied Biosystems

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구분 XS S M L XL XXL
한국 85 90 95 100 105 110
미국 85-90 90-95 95-100 100-105 105-110 110~
14 15 15.5-16 16.5 17.5 -
일본 S M L LL, XL - -
36 38 40 42 44 46
영국 0 1 2 3 4 5
프랑스 40 42, 44 46, 48 50, 52 54, 56, 58 60, 62
유럽 44-46 46 48 50 52 54
구분 XS S M L XL XXL
한국 44 (85) 55 (90) 66 (95) 77 (100) 88 (105) 110
미국·캐나다 2 4 6 8 10 12
일본 44 55 66 77 88L -
영국·호주 4-6 8-10 10-12 16-18 20-22 -
프랑스 34 36 38 40, 42 44, 46, 48 50, 52, 54
이탈리아 80 90 95 100 105 110
유럽 34 36 38 40 42 44
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구분 S M L XL
미국 남아
[Boys 2-7]
사이즈 2T 3T 4T 4 5 6 7
84-91 91-99 91-99 99-107 107-114 114-122 122-130
몸무게 13-15 14-15 13-15 14-15 19-21 20-23 23-25
미국 남아
[Boys 8-20]
사이즈 8 10 12 14 16 18 20
123-127 128-137 138-147 149-155 156-163 164-168 169-173
몸무게 25-27 27-33 34-39 40-45 46-52 52-57 58-63
미국 여아
[Girls 2-6X]
사이즈 2T 3T 4T 4 5 6 6X
84-91 91-99 91-99 99-107 107-114 114-122 122-130
몸무게 13-15 14-15 13-15 14-15 19-21 20-23 23-25
미국 여아
[Girls 7-16]
사이즈 7 8 10 12 14 16
91-99 124-130 131-135 136-140141-146 147-152 154-159
몸무게 25-27 28-30 30-34 34-38 39-44 44-50
한국(mm) 일본(cm) 인터네셔널 사이즈 미국(US) 영국(UK) 유럽(EU)
220 22 - XXXS - 5 - 3 - 36
225 22.5 - - 5.5 - 3.5 - 36 .5
230 23 XXXS XXS - 6 - 4 - 37
235 23.5 - 6.5 - 4.5 - 37.5
240 24 XXS XS 6 7 5 5 38 38
245 24.5 6.5 7.5 - 5.5 - 38.5
250 25 XS S 7 8 6 6 39 39
255 25.5 7.5 8.5 - 6.5 40.5 40
260 26 S M 8 9 7 7 40.5 40
265 26.5 8.5 9.5 7.5 7.5 41 40.마이크로 및 스탠다드 FX 계좌 5
270 27 M L 9 10 8 8 42 41
275 27.5 9.5 10.5 8.5 8.5 42.5 41.5
280 28 L XL 10 11 9 9 43 42
285 28.5 10.5 11.5 9.5 - 44 -
290 29 XL XXL 11 12 10 - 44.5 -
295 29.5 11.5 12.5 10.5 - 45 -
300 30 XXL - 12 13 11 - 46 -
305 30.5 - 12.5 - 11.5 - 46.5 -
310 31 - - 13 - 12 - 47 -
315 31.5 - - 13.5 - - - - -
320 32 - - 14 - 13 - 48 -
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raw spread 계좌 관련 문의

이번에 브로커회사를 바꿀려고 하는데 해당 회사에서
raw spread 계좌 vs. standard 계좌 두가지를 제공하고
있습니다. 2가지의 차이점에 대해서는 저도 좀 찾아보기는
했지만 제가 잘 모르는 부분에 대해서 도움 좀 부탁드리겠습니다.

1. 이번에 만들 계좌는 스켈핑/데이트레이딩 목적으로 만드는건데,
데이트레이딩 목적으로는 raw spread 계좌가 유리하다는 말이
있던데 이 말이 맞는건가요?

2. 그럼, 반대로 raw spread 계좌는 장기투자에는 불리한 측면이
있는건가요?

3. raw spread 계좌는 거래당 뭐 약 7$ 정도가 수수료로 부과된다는
것으로 이해됩니다. 1랏 거래는 7$ 정도 수수료가 징수되도 충분히
이해되는데, mini나 micro랏 거래를 할 때도 7$ 수수료가 징수되나요?
(개인적으로 제일 궁금한 부분입니다.- 꼭 답변 주시길 부탁드립니다)

4. 새로만들 계좌에 일단 600~700usd 넣고 시작할려고 하는데,
raw spread 계좌와 standard 계좌를 선택함에 있어서 종자돈의 크기는
상관 없는건가요?

Comments

해당브로커사에 물어보는게 가장 좋져. 정확하고 빠르기도 하공~ 어딘지 대충 알거 같은데요.
거긴 아마 한글, 한국어로 편하게 상담가능할거거등여.
그리고 3번의 경우는 1랏이 7달러면 0.1랏이면 0.7달러 0.01랏이면 0.07달러겠죵. 이게 미니 마이크로라고 부르나요?
암튼 비례 합니다. 외환의 경우는요.
그 외에 나머지는 제가 자세히 모르니 브로커에 문의를 추천합니다~

1. 스프레드로 하느냐, 별도의 수수료를 차감하느냐의 차이인거 같은데, 개인적으로는 뭐가 낫다고 말씀드리기는 잘 모르겠네요. 이론적으로는 그렇다고는 하는데 개인적으로는 매번 꼬박꼬박 증거금에서 차감되니 스프레드에 녹아있는 것보다는 부담스럽더라구요.
2. 그렇지는 않습니다. 장기로 갈때는 스왑이자를 보셔야 할 듯. 이건 raw 나 standard 랑 동일할 겁니다.
3. 도협님 조언처럼 비례할 듯.
4. 스프레드가 낮은 대신 수수료를 차감하는 계좌의 경우는 최소 입금액이 정해져 있을 듯 한데요. 이 부분은 확인해 보셔야 할 듯. 종자돈이야 많으면 좋죠 ㅎㅎ

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